Die Wirkung von Mycophenolatmofetil auf Podozyten bei nephrotoxischer Serumnephritis

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 14167 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Mycophenolatmofetil (MMF) wird bei proteinurischen Nierenerkrankungen eingesetzt, der genaue Wirkungsmechanismus auf Podozyten ist jedoch noch unbekannt. Unsere früheren In-vitro-Experimente legten nahe, dass MMF die Schädigung von Podozyten durch Wiederherstellung der Ca2+-Aktin-Zytoskelett-Achse lindern kann. Das Ziel dieser Studie war die Charakterisierung der Podozytenbiologie während der MMF-Behandlung bei nephrotoxischem Serum (NTS)-Nephritis (NTN). NTN wurde bei drei Wochen alten Wildtyp-Mäusen induziert. Am dritten Tag wurde die Hälfte der Mäuse eine Woche lang mit MMF (100 mg/kg KG/Tag p.o.) behandelt. Am 10. Tag führten wir eine Proteomanalyse der Glomeruli sowie eine hochauflösende Bildgebung des Schlitzdiaphragmas durch. Für die Multiphotonen-Bildgebung der Ca2+-Konzentration ([Ca2+]i) wurde der Versuchsaufbau bei Mäusen wiederholt, die einen podozytenspezifischen Ca2+-Sensor exprimierten. MMF verbesserte die durch NTS induzierte Proteinurie und Halbmondbildung. Wir identifizierten signifikante Veränderungen in der Häufigkeit von Proteinen, die an der Ca2+-Signalübertragung und der Regulierung des Aktin-Zytoskeletts beteiligt sind, was durch direkte [Ca2+]i-Bildgebung in Podozyten, die nach der MMF-Behandlung verringerte Ca2+-Spiegel zeigten, weiter bestätigt wurde. Dies war mit einer Tendenz zur Wiederherstellung der Struktur des Podozytenfußfortsatzes verbunden. Hier liefern wir den Beweis, dass MPA eine erhebliche direkte Wirkung auf Podozyten hat. MMF trägt zur Verbesserung von [Ca2+]i und zur Verbesserung des desorganisierten Aktin-Zytoskeletts in Podozyten bei. Diese Daten erweitern das Wissen über direkte Wirkungen von Immunsuppressiva auf Podozyten, die zu einer wirksameren Behandlung proteinurischer Glomerulopathien mit möglichst geringen Nebenwirkungen beitragen können.

Glomerulopathien machen weltweit 5–14 % der Kinder mit chronischer Nierenerkrankung und 15–29 % der Kinder mit Nierenversagen aus1. Viele Patienten mit Glomerulopathien können nur durch eine langjährige Behandlung mit Steroiden in Remission gehalten werden. Die Verwendung dieses Arzneimittels über einen längeren Zeitraum führt jedoch zu schwerwiegenden Nebenwirkungen. Daher haben insbesondere Kinderärzte alternative steroidsparende Therapieoptionen wie Mycophenolatmofetil (MMF) in dieser gefährdeten Bevölkerungsgruppe untersucht2.

MMF, das Prodrug der biologisch aktiven Mycophenolsäure (MPA), wirkt als wirksamer, reversibler Inhibitor von IMPDH, dem Schlüsselenzym der De-novo-Purinbiosynthese in proliferierenden Lymphozyten, und unterdrückt dadurch zellvermittelte Immunantworten und Antikörperbildung3. Die erste Studie zu den Niereneffekten von MMF zeigte, dass es den Prozess der chronischen Abstoßung von Allotransplantaten verhindert, indem es die Expression von Adhäsionsmolekülen und Zytokinen in Glomeruli verringert und so Glomerulosklerose verhindert4. In den letzten zwei Jahrzehnten wurde MMF auch bei entzündlichen Glomerulopathien etabliert und weit verbreitet eingesetzt5.

Abgesehen von der gut charakterisierten immunsuppressiven Wirkung wissen wir wenig darüber, wie MMF direkt auf das Nierengewebe, insbesondere Podozyten, wirkt6,7. Bei diabetischer Nephropathie wurden in der mit MMF behandelten Gruppe eine geringere Apoptoserate der Podozyten und eine erhaltene Expression von Nephrin und Podocin beobachtet8. Dies steht im Einklang mit den Ergebnissen eines Puromycin-Modells, bei dem die Hemmung von IMPDH den ATP-Pool wiederherstellte, der die Nephrin- und Synaptopodin-Expression aufrechterhielt und das Aktin-Zytoskelett stabilisierte9. Darüber hinaus haben Fu et al. zeigten eine direkte Wirkung von MMF bei einer immunvermittelten Nierenerkrankung: MRL/lpr-Mäuse wurden mit MMF behandelt. Anschließend zeigte die an isolierter Nierenrinde durchgeführte RNA-Sequenzierung eine signifikante Abnahme der Rac1-Genexpression, die bei Aktivierung die physiologische Stressfaserbildung stört10. Dementsprechend ergaben unsere früheren In-vitro-Experimente zur RNA-Sequenzierung einer mit MPA behandelten Podozyten-Zelllinie eine Häufung der Begriffe „Aktin-Zytoskelett“ und „Regulation der durch kleine GTPase vermittelten Signaltransduktion“. Darüber hinaus wurden auch die Begriffe „Kalziumkanalaktivität“ und „Kalziumionentransport“ erweitert11. Der Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration ([Ca2+]i) in Podozyten12 kann zu einer akuten Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts oder sogar zum Zytoskelettkollaps und Proteinurie führen13,14,15,16. In der vorliegenden Studie wollten wir bestätigen, ob MMF auch in der Lage ist, Podozytenschäden durch Wiederherstellung der Ca2+-Aktin-Zytoskelettachse in einem In-vivo-Modell der nephrotoxischen Serumnephritis (NTN) zu lindern.

C57BL6-Mäuse sowie Pod:cre tg/wt GCaMP3 fl/fl-Mäuse im C57BL6-Genhintergrund wurden gemäß den standardisierten spezifischen pathogenfreien Bedingungen in der Tierhaltung der Universität zu Köln gehalten. GCaMP3-Mäuse wurden von JAX Laboratories (Stamm 014538) bereitgestellt, Pod:cre-Mäuse17 stammen aus einer etablierten Kolonie (> 10 Jahre) in unserem Vivarium. Alle Tierversuche wurden gemäß den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften des LANUV NRW (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen) durchgeführt. Das Versuchsprotokoll wurde vom LANUV NRW (VSG81-02.04.2020.A052) geprüft und genehmigt, das sich an die 3R-Grundsätze hielt. Jede Maus wurde als n = 1 betrachtet. Insgesamt 13 Mäuse (5 Weibchen, 8 Männchen) bildeten die Kontrollgruppe, 11 Mäuse (7 Weibchen, 4 Männchen) die NTS + Veh-Gruppe und 12 Mäuse (7 Weibchen, 5 Männchen) die NTS + MMF-Gruppe. NTN wurde bei drei Wochen alten Mäusen (die Nephrogenese ist bereits abgeschlossen, sie sind aber noch nicht geschlechtsreif) wie folgt induziert: Die Tiere erhielten eine intraperitoneale Injektion von nephrotoxischem Serum (NTS; Probetex, San Antonio, USA) in einer Dosis von 10 µl /g Körpergewicht (KG) an zwei aufeinanderfolgenden Tagen. Aus pathogenetischer Sicht ist der historisch geprägte Begriff „nephrotoxisch“ irreführend, da das Serum einen immunvermittelten Prozess induziert. Im Einzelnen lagern sich nephrotoxische Antikörper (heterologe Schaf-Antikörper gegen ganze Rattenglomeruli) im gesamten Glomerulus ab, einschließlich der subepithelialen, subendothelialen Bereiche und des Mesangiums. Anschließend kann eine mesangiale Proliferation und Halbmondbildung beobachtet werden. Somit dient NTN als Modell für eine immunvermittelte Glomerulopathie mit Proteinurie (Abb. 1a). In unserer Studie zeigten alle NTS-injizierten Mäuse am 3. Tag Proteinurie. Als Kontrolle dienten Mäuse ohne NTS-Induktion. Störfaktoren wurden nicht kontrolliert. Am dritten Tag wurde sieben Tage lang entweder Wasser (NTS + Fahrzeug) oder MMF (Roche, Mannheim, Deutschland) in einer Dosis von 100 mg/kg KG/Tag (NTS + MMF) per Schlundsonde verabreicht. Anschließend wurden sie mit Ketamin und Xylazin anästhesiert, gefolgt von einer Herzblutentnahme und durch Herzperfusion mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) getötet. Abhängig von der weiteren Untersuchungstechnik wurden Mäuse zusätzlich mit 4 % Paraformaldehyd perfundiert. Die Nieren wurden entnommen und entweder in geschmolzene Agarose für akute Nierenschnitte (AKS) oder in 4 % neutral gepuffertes Formalin für die Bildgebung mit stimulierter Emissionsdepletion (STED) gelegt. Vor der Injektion von NTS, am dritten und am letzten Tag wurden punktuelle Urinproben entnommen. Der Versuchsaufbau ist in Abb. 1b dargestellt.

Panel (a) zeigt den zugrunde liegenden Pathomechanismus der nephrotoxischen Serumnephritis. Nephrotoxische Antikörper (heterologe Schaf-Antikörper gegen ganze Rattenglomeruli) (rot) lagern sich im gesamten Glomerulus ab, einschließlich der subepithelialen, subendothelialen Bereiche sowie des Mesangiums, was histologisch zu mesangialer Proliferation (blau) und Halbmondbildung (schwarz) und klinisch zu immunologischen Reaktionen führt. vermittelte Glomerulopathie mit Proteinurie. Zum Zeitpunkt der Ernte befinden sich glomeruläre Zellen in einer komplexen entzündlichen Umgebung (violett), in der Th17- und Th1-Zellen dominieren, begleitet von proinflammatorischen cDC2s und ausgleichenden cDC1s-Zellen. Erstellt mit BioRender.com Panel (b) zeigt das Design und den Zeitplan unserer Studie. Bei drei Wochen alten Mäusen wurde durch intraperitoneale Injektion von nephrotoxischem Serum an zwei aufeinanderfolgenden Tagen eine nephrotoxische Serumnephritis induziert. Am dritten Tag nach der Proteinurie-Induktion wurde sieben Tage lang entweder Vehikel oder MMF in einer Dosis von 100 mg/kg KG/Tag oral verabreicht, und dann wurden die Mäuse getötet. Als Kontrolle dienten Mäuse ohne NTS-Induktion. NTS: nephrotoxisches Serum, MMF: Mycophenolatmofetil.

Mäuse wurden mithilfe von DNA, die aus Ohrbiopsien isoliert wurde, genotypisiert. Für Pod:cre tg/wt GCaMP3 fl/fl-Mäuse wurde die DNA durch PCR unter Verwendung von REDTaq ReadyMix (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) amplifiziert und mittels Gelelektrophorese sichtbar gemacht. Alle verwendeten Primer und die jeweilige in der Gelelektrophorese ermittelte Fragmentgröße sind in Suppl aufgeführt. Tabelle 1.

Die Quantifizierung der Albuminspiegel im Urin wurde mit einem Maus-Albumin-ELISA-Kit (ICL/Dunn Labortechnik, Asbach, Deutschland) durchgeführt und die Kreatininspiegel wurden mit einem Kreatinin-Kit im Urin (Biomol, Hamburg, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen.

In den für die Histopathologie vorgesehenen Nieren wurde eine Dehydrierung und Einbettung in Paraffin durchgeführt. Nierengewebe wurde geschnitten und die Schnitte auf Objektträger übertragen. Zur Beurteilung der Glomerulosklerose wurde eine Periodsäure-Schiff-Färbung (PAS) durchgeführt. Kurz gesagt, die Schnitte wurden in Xylol entparaffiniert und anschließend in einer absteigenden Ethanolreihe rehydratisiert. Nach jeweils 10-minütiger Inkubation in 0,9 % Periodensäure (Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland), Schiff-Reagenz (Merck, Darmstadt, Deutschland) und Mayer-Hämatoxylin (Merck) wurden die Schnitte in einer aufsteigenden Ethanolreihe und Xylol dehydriert und mit bedeckt HistoMount (National Diagnostics, Atlanta, USA). Für die Bildaufnahme wurde ein NanoZoomer S360 (Hamamatsu, Geldern, Deutschland) verwendet. Um das Ausmaß der glomerulären Schädigung zu bestimmen, wurde die Anzahl der sichelförmigen Glomeruli blind gezählt. Halbmonde wurden als zwei oder mehr Zellschichten im Bowman-Raum definiert. Pro Niere wurden mindestens 50 Glomeruli untersucht18.

Am letzten Tag des Experiments, 24 Stunden nach der letzten MMF-Dosis, wurden NTS + MMF-Mäuse einem Wangenschlagverfahren unterzogen, um die Blutprobe für MPA-C0 des therapeutischen Arzneimittelmonitorings (TDM) bereitzustellen, gefolgt von der letzten Dosis von Geldmarktfonds. Nach 30 Minuten wurde eine Endblutentnahme durchgeführt, die als MPA-C30 von TDM diente. Dementsprechend wurde eine begrenzte Stichprobenstrategie verwendet. Die geschätzte MPA-Fläche unter den Konzentrations-Zeit-Kurvenprofilen (eMPA-AUC0–24 h) wurde aus plasmatischen MPA-Konzentrationen abgeleitet und auf der Grundlage eines Bayesian-Fitting-Ansatzes mit einem Zwei-Kompartiment-Modell unter Verwendung des Pharmakokinetik-Softwarepakets MW/Pharm ++ berechnet (lizenzierte Version)19.

Nach der Tötung durch Zervixluxation wurden die Nieren von Wildtyp-Mäusen mit Dynabeads perfundiert, um Glomeruli wie beschrieben zu isolieren20. Die isolierten Glomeruli wurden in 500 µL 1 × Hanks' Balanced Salt Solution resuspendiert und 5 Minuten lang bei 4 °C und 1500 U/min zentrifugiert, anschließend wurde der Überstand entfernt. Die Pellets wurden in 50 µL SP3-Puffer mit 5 % SDS resuspendiert und erneut 5 Minuten lang bei 4 °C und 15.000 g zentrifugiert. Anschließend wurde das Chromatin in einem Bioruptor®-Ultraschallgerät abgebaut. Die Reaktionsgefäße wurden in ein magnetisches Gestell gestellt, um die Dynabeads aus den Proben zu entfernen. Der Überstand wurde bei 95 °C gekocht und dann 2 Minuten lang bei 4 °C und 15.000 g zentrifugiert. Die Proteinkonzentration wurde nach einem Standardverfahren unter Verwendung eines BCA-Kits21 bestimmt. Die Konzentration jeder Probe wurde mit 1 × SP3-Puffer auf 4 µg eingestellt. Das glomeruläre Proteom wurde mit einem Massenspektrometriesystem analysiert, das einen Q ExactivePlusOrbitrap und einen EASY nLC 1000 mit einer C18-Analysesäule enthielt. Das detaillierte Verfahren wurde an anderer Stelle beschrieben22. Die statistische Analyse wurde mit der Perseus-Software (Version 1.5.5.3)23 und dem Paket Limma in R24 durchgeführt. Für den Datensatz wurden eine einfaktorielle ANOVA und ein T-Test mit zwei Stichproben angewendet, nachdem Proteine nach drei gültigen Werten in mindestens einer Gruppe gefiltert wurden. Ein erkanntes Protein wurde als gültig definiert, wenn mindestens zwei Peptide des Proteins identifiziert wurden. Die Limma-Funktionen lmFit, eBayes und topTable wurden mit Standardeinstellungen für die gefilterten log2-transformierten Proteinintensitäten verwendet, um p-Werte und log2-fache Änderungen zu berechnen. Ein p-Wert von 0,05 wurde ohne weitere Korrektur für mehrere Tests als signifikant angenommen. Darin sind veränderte Proteine mit einer log2-fachen Änderung (fc) von ≥|0,58| enthalten (fc ≥ 1,5) wurden als relevant verändert eingestuft. Proteine, die diese Kriterien erfüllten, wurden weiter analysiert. Für die Funktionsanalyse wurden GraphPad Prism v.9.0.2, Uniprot Protein Knowledgebase und ShinyGO (v.0.75)25 verwendet.

Mäusenieren von Pod:cre tg/wt GCaMP3 fl/fl-Mäusen wurden direkt postmortal entnommen und dann in 4 % niedrig schmelzende Agarose bei 37 °C eingebettet. Die Niere in Agarose wurde in 300 µm dicke Scheiben geschnitten und bei 4 °C aufbewahrt. Zur Bildgebung wurde AKS auf den Mikroskoptisch übertragen, der Krebs-Henseleit-Puffer bei RT enthielt und mit 95 % O2 und 5 % CO2 infundiert war. Die Ex-vivo-Bilder wurden mit einem aufrechten Multiphotonenmikroskop (TCSSP8 MP-OPO, Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) aufgenommen. Der Multiphotonenlaser (Chameleon VisionII, Coherent, Dieburg, Deutschland) wurde auf 940 nm eingestellt, ein 25-fach-Wasserobjektiv (numerische Apertur 0,95) wurde verwendet und die Bilder wurden unter Verwendung eines nicht-descannierten Hybriddetektors mit einem FITC/TRITC (525) aufgezeichnet /50) Filtersatz. Z-Stapel wurden in 2-µm-Schritten erstellt. Zur Analyse der Ca2+-Spiegel in Podozyten wurden ROIs auf Maximalintensitätsprojektionen von Z-Stapeln einzelner Glomeruli platziert und die mittlere Fluoreszenzintensität mit ImageJ quantifiziert. Mindestens zwanzig Glomeruli pro Schnitt und zwei Schnitte pro Tier wurden von einem für die Behandlung blinden Beobachter abgebildet und analysiert.

Das Protokoll der optischen Reinigung und Immunmarkierung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt26,27. Supp. Tabelle 2 zeigt die verwendeten Antikörper. Die Quantifizierung der SD-Länge folgte zuvor beschriebenen Methoden27 unter Verwendung eines ImageJ-Makros, das in GitHub Gist zu finden ist: https://gist.github.com/github-martin/e699d18ae6cfa5b1a6aace15d3c3544c.

Alle Methoden werden gemäß den ARRIVE-Richtlinien gemeldet.

Alle Mäuse zeigten am 3. Tag eine schwere Proteinurie (Abb. 2a). Die durchschnittliche Proteinurie zu diesem Zeitpunkt, vor Beginn der MMF-Behandlung, unterschied sich nicht signifikant zwischen NTS + veh- und NTS + MMF-Mäusen. Wichtig ist, dass eine einwöchige Behandlung mit MMF zu einem bemerkenswerten Unterschied in der Verringerung der Proteinurie im Vergleich zur NTS + Veh-Gruppe führte (Abb. 2b). Dementsprechend zeigte die histologische Analyse einen signifikanten Anstieg der Anzahl halbmondförmiger Glomeruli in der NTS + veh-Gruppe, wohingegen NTS + MMF-Tiere einen deutlich geringeren glomerulären Halbmond aufwiesen (Abb. 2c). Die wirksame Exposition gegenüber der MMF-Verabreichung wurde durch TDM bestätigt, die durchschnittliche eMPA-AUC0–24 h betrug 25,6 ± 13,9 mg*h/L.

Die MMF-Therapie mildert Nierenschäden im NTN-Modell. Tafel (a) zeigt das Albumin-Kreatinin-Verhältnis im Urin am Tag 3. Die Proteinurie von NTS + veh und NTS + MMF unterschied sich nicht signifikant. Tafel (b) zeigt das Albumin-Kreatinin-Verhältnis im Urin am Tag 10. Eine einwöchige Behandlung mit MMF in einer Dosis von 100 mg/kg KG/Tag führte zu einem moderaten Unterschied in der Reduzierung der Proteinurie bei nephrotoxischer Serumnephritis. Panel (c) zeigt den Prozentsatz der sichelförmigen Glomeruli in jeder Gruppe. NTS + MMF-Tiere zeigten im Vergleich zu NTS + veh-Mäusen deutlich weniger glomeruläre Halbmonde. NTS + Fahrzeug n = 4; NTS + MMF n = 4. Zur Bestimmung der statistischen Signifikanz wurde der ungepaarte t-Test verwendet. Die Signifikanz wurde bei p < 0,05 erreicht. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. NTS: nephrotoxisches Serum, MMF: Mycophenolatmofetil, ns: nicht signifikant, *** p < 0,001* p < 0,05.

Um die molekularen Mechanismen während der MMF-Therapie bei NTN aufzuklären, führten wir eine Proteomik von Glomeruli gesunder Kontrollen, NTS + veh- und NTS + MMF-Mäusen, durch. Insgesamt wurden 3.650 glomeruläre Proteine nachgewiesen. Von ihnen wurden 173 Proteine herunterreguliert und 192 Proteine signifikant (p-Wert von < 0,05) und relevant (lineare Faltungsänderung von > 1,5) hochreguliert, wenn NTS + MMF mit NTS-Gruppen verglichen wurden. Um molekulare Funktionen und biologische Prozesse zu klären, die von MMF-regulierten Proteinen beeinflusst werden, führten wir Gen-Ontologie-Analysen (GO) durch. Abbildung 3 zeigt eine Auswahl wichtiger GO-Begriffe. Aus der Anreicherungsanalyse konnten wir zwei Hauptgruppen von Begriffen ableiten, die von besonderem Interesse waren: Ca2+-Signalisierung und Regulierung des Aktin-Zytoskeletts (Abb. 3a, b). Von den zahlreichen identifizierten Proteinen mit einem ap-Wert < 0,05 (Supp. Table 3) analysierten wir diejenigen, die mit der Ca2+-Signalisierung und/oder der Aktin-Zytoskelett-Regulierung zusammenhängen und als Heatmap angezeigt wurden (Abb. 4a, b). Darüber hinaus wird die Verteilung der wichtigsten Proteine für die Ca2+-Signalisierung und die Regulierung des Aktin-Zytoskeletts im Vulkandiagramm dargestellt (Abb. 4c). Für die Ca2+-Signalisierung erregten zwei Proteine unser Interesse (Supp. Table 3). Wbp2, was zum Ca2+-Einstrom vom ER in das Zytoplasma führt. Darüber hinaus Stim2, das für den Ca2+-Einstrom von der extrazellulären in die intrazelluläre Flüssigkeit verantwortlich ist. Beide waren bei NTS + MMF-Mäusen im Vergleich zur NTS + Veh-Gruppe signifikant herunterreguliert. Dementsprechend konnten wir signifikante Veränderungen in der Expression von Ca2+-abhängigen Proteinen wie Cpne1, Cpne4, Cpne8, Fbln1, Fbln2 und Rasgrp2 feststellen (Supp. Table 3). Eine weitere Gruppe veränderter Proteine war an der Regulierung des Aktin-Zytoskeletts beteiligt. Das Proteinexpressionsniveau mehrerer positiver Regulatoren für Rac1 wie Micall2, Dock7, Trio und Fgd5 war in der NTS + MMF-Gruppe im Vergleich zur NTS + veh-Gruppe stark herunterreguliert (Supp. Table 3). In diese Richtung weist auch die deutliche Verringerung des Expressionsniveaus des Downstream-Proteins Wasf2 (Supp. Table 3). Darüber hinaus stellten wir fest, dass das Expressionsniveau von Arhgap29, einem positiven Regulator für RhoA, stark hochreguliert ist (Supp. Tabelle 3). Dies stand im Einklang mit dem erhöhten Proteingehalt von Spn und Eif5a, von denen bekannt ist, dass sie die Bildung von Stressfasern fördern (Supp.-Tabelle 3). Schließlich beobachteten wir ein verringertes Expressionsniveau der Lamellipodien, die Shank3 induzieren (Supp. Table 3).

Funktionsanalyse von signifikant (p < 0,05) und relevant (log2-fache Änderung >|0,58|) veränderten Proteinen aus dem Glomeruli-Proteom, analysiert mit der ShinyGo Gene Ontology (GO) Enrichment Analysis. Panel (a) zeigt den Vergleich zwischen NTS- und Kontrollmäusen (NTS-Effekt). Panel (b) zeigt den Vergleich zwischen NTS + MMF- und NTS + veh-Mäusen (Therapieeffekt). Links: die Lollipop-Grafik der veränderten GO Molecular Functions; rechts: Netzwerkanalyse der veränderten GO Molecular Functions. Kontrollen n = 4; NTS + Fahrzeug n = 4; NTS + MMF n = 6; NTS: nephrotoxisches Serum; MMF: Mycophenolatmofetil.

Panel (a) zeigt die Heatmap von Proteinen, die mit dem Signalweg „Kalziumsignal“ in Zusammenhang stehen, während Panel (b) die Heatmap von Proteinen zeigt, die mit dem Signalweg „Aktin-Zytoskelett“ in Zusammenhang stehen. Die Proteine, die in der NTS + veh-Gruppe im Vergleich zu den Kontrollen ein signifikant unterschiedliches Expressionsniveau aufwiesen, wurden als „NTS-Effekt“ betrachtet. Während die Proteine, die in der NTS + MMF-Gruppe im Vergleich zur NTS + veh-Gruppe ein signifikant unterschiedliches Expressionsniveau aufwiesen, als „Therapieeffekt“ angesehen wurden. Ein unverändertes Expressionsniveau in der mittleren Reihe (NTS + MMF vs. Kontrolle) deutete auf eine therapiebedingte Rückkehr zum Normalzustand hin, was darauf hindeutet, dass MMF bestimmte Zellwege wirksam wiederherstellte. Der p-Wert < 0,05 ist mit einem Sternchen * gekennzeichnet; Die Farbkartierung zeigt die Faltungsveränderung jedes Proteins: Blau steht für eine Herunterregulierung, während Orange für eine Hochregulierung steht. Panel (c) hebt interessante Proteine auf einem Vulkanplot aus dem Vergleich NTS + Fahrzeug vs. NTS + MMF hervor. Kontrollen n = 4; NTS + Fahrzeug n = 4; NTS + MMF n = 6; NTS: nephrotoxisches Serum, MMF: Mycophenolatmofetil.

Die effektive Exposition gegenüber MPA wird indirekt durch die kompensatorische Hochregulierung von IMPDH2, dem Hauptziel von MPA, bestätigt (siehe PRIDE-Repository).

Um das [Ca2+]i quantitativ zu bestimmen, verwendeten wir eine transgene Mauslinie mit podozytenspezifischer Expression des Ca2+-Indikators GCaMP3 für einen Multiphotonen-Bildgebungsansatz auf AKS. Die Multiphotonen-Bildgebung zeigte eine geringe GCaMP3-Fluoreszenz in gesunden Podozyten von Kontrollpersonen und nur geringe Unterschiede zwischen verschiedenen Glomeruli (Abb. 5a). Die Induktion mit NTS induzierte stark einen deutlichen Anstieg von [Ca2+]i in Podozyten, was durch Veränderungen in der Fluoreszenz von GCaMP3 angezeigt wurde (Abb. 5b, d, e). Die Behandlung mit MMF führte zu einer moderaten, aber signifikanten Abnahme des [Ca2+]i der Podozyten (Abb. 5c, d, e).

Repräsentative Bilder eines Glomerulus einer Pod:cre GCaMP3 (grün)-Maus zeigen das Kalziumsignal im nephrotoxischen Serumnephritis-Modell. Panel (a) zeigt eine niedrige Signalintensität des physiologischen [Ca2+]i mit nur geringfügigen Variationen zwischen verschiedenen Glomeruli. Panel (b) zeigt die ausgeprägte Signalintensität der NTS-induzierten Ca2+-Reaktion. Panel (c) zeigt eine moderate, aber signifikante Abnahme der Signalintensität, was auf einen niedrigeren Gesamt-[Ca2+]i in Podozyten nach MMF-Behandlung hinweist. Panel (d) zeigt die Quantifizierung des Ca2+-Signals, wobei die Werte der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität eines Glomerulus entsprechen, und Panel (e) zeigt die Quantifizierung des Ca2+-Signals, wobei die Werte der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität einer Maus entsprechen. Maßstabsleiste: 20 µm. steuert n = 5; NTS + Fahrzeug n = 5, NTS + MMF n = 3; Für die Quantifizierung wurden mindestens zwanzig Glomeruli pro Scheibe und zwei Scheiben pro Tier verwendet. Zur Bestimmung der statistischen Signifikanz wurden eine einfaktorielle ANOVA und ein T-Test mit zwei Stichproben verwendet. Die Signifikanz wurde bei p < 0,05 erreicht. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. **** p < 0,0001, ** p < 0,01 * p < 0,05; NTS: nephrotoxisches Serum, MMF: Mycophenolatmofetil, Veh: Vehikel; ns: nicht signifikant.

Um ultrastrukturelle Veränderungen der Fußfortsatzmorphologie zu beurteilen, verwendeten wir hochauflösende STED-Bildgebung von Glomeruli. Wir quantifizierten morphologische Veränderungen durch Messung der SD-Länge, die durch Nephrin-Immunfärbung sichtbar gemacht wurde. Kontrolltiere zeigten dichte SD-Muster gesunder, verlängerter Fußfortsätze (FPs) (Abb. 6a). Im Gegensatz dazu zeigten durch NTS verletzte Podozyten morphologische Veränderungen wie eine Verringerung der Anzahl und Verbreiterung der FPs sowie eine signifikante Verkürzung der SD-Länge (Abb. 6b). Wichtig ist, dass die MMF-Therapie diese morphologischen Veränderungen verbesserte (Abb. 6c). Obwohl Abb. 6d, e einen klaren Trend zeigt, wurde kein signifikanter Unterschied zwischen NTS + MMF- und NTS + veh-Mäusen festgestellt. Bemerkenswert ist, dass ein gesundes SD-Muster auf ein intaktes Aktin-Zytoskelett hinweist, wie durch eine Synaptopodin-Kofärbung gezeigt wird, wohingegen eine Verbreiterung und Verkürzung der Fußfortsätze mit einer Störung der Aktin-Stressfasern einhergeht (Supp. Abb. 1).

STED-Mikroskopie der Podozyten-Fußfortsatzarchitektur im nephrotoxischen Nephritis-Modell. Das Ergebnis der halbautomatischen SD-Segmentierung wird zusammen mit dem manuell zugewiesenen ROI als Overlay in allen Bildern angezeigt (gelb). Bild (a) zeigt ein gesundes, regelmäßiges Färbemuster der Fußfortsätze, das durch die Nephrin-Färbung dargestellt wird. Panel (b) zeigt morphologische Veränderungen nach der NTS-Induktion, wobei das Nephrin-Färbemuster weniger dicht erscheint, was zu einer deutlichen Verkürzung der SD-Länge führt. Panel (c) zeigt einen leichten Trend zur Normalisierung der ultrastrukturellen Veränderungen der Fußfortsätze. Panel (d) zeigt die Quantifizierung der SD-Länge, wobei die Werte dem Durchschnitt eines Glomerulus entsprechen, und Panel (e) zeigt die Quantifizierung der SD-Länge, wobei die Werte dem Durchschnitt einer Maus entsprechen. Maßstabsbalken: 5 µm; steuert n = 5, NTS + Fahrzeug n = 4, NTS + MMF n = 3; Für die Quantifizierung wurden mindestens fünf Bilder pro Maus verwendet. Zur Bestimmung der statistischen Signifikanz wurden eine einfaktorielle ANOVA und ein T-Test mit zwei Stichproben verwendet. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. **** p < 0,0001, *** p < 0,001; NTS: nephrotoxisches Serum, MMF: Mycophenolatmofetil, Veh: Vehikel; ns: nicht signifikant.

Dies ist die erste Studie, die die molekularen Wirkungen von MMF auf der Ebene des glomerulären Proteoms im NTN-Modell mit einem klinisch relevanten Behandlungsprotokoll untersucht. Wir fanden heraus, dass MMF die Proteinurie und die glomeruläre Halbmondbildung innerhalb einer Woche linderte. Wir identifizierten eine signifikant veränderte Proteinexpression im Zusammenhang mit der Ca2+-Signalübertragung und der Regulierung des Aktin-Zytoskeletts, was durch direkte [Ca2+]i-Bildgebung in Podozyten weiter bestätigt wurde und eine Verbesserung nach MMF-Behandlung zeigte. Diese funktionelle Veränderung führte zu einer Tendenz zur strukturellen Stabilisierung der Podozyten-FPs. Somit deuten unsere Daten darauf hin, dass MMF eine positive Wirkung auf NTN hat, teilweise durch die Wiederherstellung der Ca2+-Aktin-Zytoskelett-Achse in Podozyten.

Das NTN-Modell verfügt über mehrere Vorteile eines immunologisch ausgelösten Pathomechanismus und einer schnellen Induktionsphase. Dies ermöglichte es uns, junge Mäuse im Alter von viereinhalb Wochen, wenn die Nieren noch wachsen, zu untersuchen, um die dynamischen immunologischen Veränderungen in unserer pädiatrischen Population zu modellieren. Darüber hinaus spiegelt unser Induktions- und Behandlungsprotokoll die klinische Realität von Glomerulopathien im Kindesalter wider, da der Beginn der Therapie nicht präventiv war, sondern drei Tage nach Ausbruch der Krankheit bis zu einem Zeitpunkt anhielt, an dem alle Versuchstiere Proteinurie zeigten. Um die angewendeten Dosen zu überwachen, haben wir TDM über MPA-AUC0–24 h etabliert, was das erste Mal ist, dass es in einem Mausmodell implementiert wird. Durch die Durchführung einer TDM von MPA konnten wir eine effektive Exposition gegenüber MPA nachweisen. Aus früheren klinischen Studien wissen wir, dass ein geschätzter MPA-AUC die MPA-Exposition zuverlässiger widerspiegelt und besser mit dem klinischen Ergebnis korreliert als MPA-C0-Werte28,29,30.

Wir wollten die unterschiedlichen molekularen Signalwege aufklären, die für die Renoprotektion durch die Verabreichung einer MMF-Therapie in unserem NTN-Modell verantwortlich sein könnten. Ein Vergleich der Proteomikprofile zeigte, dass die Begriffe „Ca2+-Signal“ und „Aktin-Zytoskelett-Regulation“ nach der MMF-Behandlung angereichert waren, was auf ihre Rolle bei der Verbesserung der Nierenschädigung bei NTN schließen lässt. Der Ca2+-abhängige Umbau des Aktin-Zytoskeletts ist ein dynamischer Prozess, der die Anpassung von Podozyten an physiologische und widrige Bedingungen ermöglicht. Folglich kann eine Störung dieses dynamischen Prozesses zur Ablösung von der Basalmembran und zum Verlust von Podozyten führen. Dieser dynamische Prozess wird durch die Modulation der Aktivität von Mitgliedern der Rho-Familie kleiner GTPasen reguliert. RhoA fördert die Bildung von Stressfasern, um stabile Fußprozesse zu erzeugen. Im Gegensatz dazu fördert Rac1 die krankheitsassoziierte Zellmotilität31,32. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass einige der Immunsuppressiva das Aktin-Zytoskelett von Podozyten bewahren10,33,34. Im Einklang mit diesen Daten fanden wir heraus, dass MMF einen direkten Einfluss auf das Proteom glomerulärer Zellen hat (Abb. 7): MMF verringerte die Proteinexpression von Stim2, das den Ca2+-Zustrom durch die speichergesteuerten Ca2+-Kanäle reguliert35,36. Darüber hinaus verringerte MMF die Proteinexpression von Wbp2, was die Ca2+-Freisetzung aus ER37 beeinflussen könnte. Ähnlich wie bei früheren veröffentlichten proteomischen Analysen von Glomeruli38 konnten wir TRPC-Kanäle nicht quantifizieren, vermutlich aufgrund ihrer sehr geringen Häufigkeit. Dennoch wurde zuvor gezeigt, dass der Membraneinbau von TRPC5 aktiviertes Rac139,40,41 erfordert, das wiederum durch MMF in einem murinen Lupus-Modell herunterreguliert wurde10. Dies wird durch unsere Proteomikdaten gestützt, bei denen die Expression mehrerer Proteine (Trio, Fgd5, Micall2, Dock7), die Rac1 aktivieren, verringert war. Darüber hinaus wurde Wasf2, ein Downstream-Ziel des Rac1-Signalwegs, herunterreguliert, was auch in unserem Modell auf eine geringere Aktivierung von Rac1 hinweist. Anschließend gehen wir davon aus, dass die Rückkopplungsschleife zwischen Rac1-TRPC5-Ca2+Influx-Rac139 durch MMF zumindest teilweise gestört wird. Insgesamt zielt MMF auf mehrere Signalwege ab und reduziert den gesamten Ca2+-Einstrom in das Zytoplasma, was sich weiter auf nachgeschaltete Signalwege auswirkt. Dementsprechend kann MMF Zellfunktionen beeinflussen, indem es die Expression von Ca2+-abhängigen Proteinen verändert: z. B. Aktivierung von Integrin durch Rasgrp2, Stabilisierung der extrazellulären Matrix durch Fibuline und verschiedene Kaskaden durch Copinine. Darüber hinaus kann eine mögliche Blockierung der Calmodulin-Calcineurin-Achse die Spaltung von Synaptopodin und RhoA verhindern, wie bereits beschrieben42. Darüber hinaus führte die MMF-Behandlung zu Expressionsveränderungen mehrerer regulatorischer Proteine von Rac1, die alle in Richtung der Inaktivierung von Rac1 wirkten. Während die verminderte Expression von Arhgap29 die Aktivierung von RhoA förderte. Unser Datensatz legt daher nahe, dass MMF eine wechselseitige Regulierung der RhoA- und Rac1-Signalwege vermittelt, was zur allgemeinen Erhaltung von Stressfasern und dem stationären Phänotyp von Podozyten führt. Dies wurde weiter durch die Veränderungen von Proteinen wie Spn, Eif5a, Mylpf, Calml4 und Shank3 angezeigt. Unsere Proteomanalyse ergab, dass MMF das Ca2+-Signal positiv beeinflussen und die Bildung von Stressfasern erleichtern kann. Obwohl diese Daten von Zellen der gesamten Glomeruli stammen, werden sie höchstwahrscheinlich von Podozyten beeinflusst, da diese stark auf einer intakten Ca2+-Aktin-Zytoskelett-Achse beruhen14. Dies steht auch im Einklang mit unseren früheren In-vitro-Experimenten11, die wir durchgeführt haben, um den Einfluss von Immunzellen auszuschließen und die direkte Wirkung von MPA auf Podozyten zu untersuchen. Dabei ergab unsere RNA-Sequenzierung einer MPA-behandelten Podozyten-Zelllinie eine Anhäufung von Begriffen, darunter „Kalziumkanalaktivität“, „Kalziumionentransport“, „Aktin-Zytoskelett“ und „Regulierung der durch kleine GTPase vermittelten Signaltransduktion“. Dies führt möglicherweise zu einer Normalisierung von [Ca2+]i in Podozyten und zu einer Verbesserung des desorganisierten Aktin-Zytoskeletts, was auch durch Immunfluoreszenzfärbung nachgewiesen wurde11.

Molekulare Veränderungen in Podozyten nach MMF-Behandlung bei nephrotoxischer Serumnephritis. Beim Vergleich von NTS + veh mit NTS + MMF identifizierten wir signifikant veränderte Proteinexpressionen im Zusammenhang mit der Ca2+-Signalübertragung, wodurch der Ca2+-Einstrom in das Zytoplasma insgesamt reduziert wurde. Dieses teilweise normalisierte [Ca2+]i kann die Expression von Ca2+-abhängigen Proteinen beeinflussen und die Spaltung von Synaptopodin und RhoA verhindern. Darüber hinaus führt die MMF-Behandlung zu Expressionsänderungen mehrerer regulatorischer Proteine von Rac1, die in Richtung einer Rac1-Inaktivierung wirken. Gleichzeitig fördert es die Aktivierung von RhoA und die Expression anderer Proteine, was insgesamt zur Erhaltung von Stressfasern und dem stationären Phänotyp von Podozyten führt. Die Hochregulierung ist orange, die Herunterregulierung blau gefärbt. Rote Kreise markieren die Signalwege (1–3), die durch die MMF-Behandlung beeinflusst werden und zur Wiederherstellung von [Ca2+]i führen können. Erstellt mit BioRender.com.

Um unsere Proteomikdaten zu Ca2+-verwandten Proteinen in Podozyten zu validieren, führten wir eine Multiphotonenmikroskopie an AKS von Mäusen durch, die das [Ca2+]i-Sensorprotein GCaMP3 spezifisch in Podozyten exprimierten13,15. Die Verwendung von AKS ermöglicht die dreidimensionale Darstellung vieler Glomeruli und reduziert den Selektionsbias. Dies ist in unserem NTN-Modell aufgrund der heterogenen Population glomerulärer Läsionen besonders vorteilhaft. Der Anstieg von [Ca2+]i ist ein frühes Ereignis einer Podozytenschädigung12 und der Überschuss an [Ca2+]i kann zu einer akuten Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts oder sogar zum Kollaps des Zytoskeletts führen13,14,15,16. Daher ist die strenge Kontrolle des [Ca2+]i in diesen Zellen unerlässlich. Wir haben in unserem Krankheitsmodell auch einen signifikanten Anstieg von [Ca2+]i festgestellt, der zur Aktivierung pathologischer Signalwege in NTN beitragen könnte. Wichtig ist, dass die MMF-Therapie den erhöhten [Ca2+]i in Podozyten reduzierte. Zusammenfassend stimmten unsere Proteomik- und Bildgebungsdaten überein: Die verringerte Expression von Ca2+-Kanal-auslösenden Proteinen und die angezeigte verringerte Aktivierungsrate von Rac1 in MMF-behandelten Mäusen wurden durch die direkte Visualisierung des reduzierten Podozyten-[Ca2+]i nach der Behandlung mit MMF bestätigt .

Um die Proteomikdaten im Zusammenhang mit der Regulierung des Aktin-Zytoskeletts und deren Auswirkungen auf die FP-Struktur der Podozyten zu validieren, haben wir die STED-Mikroskopie-Bildgebung von FPs angewendet, die es uns ermöglicht, nach Proteinen der Filtrationsbarriere zu färben26,27. In der vorliegenden Studie haben wir eine signifikant verringerte SD-Länge in der NTN-Gruppe festgestellt, was auf eine Funktionsstörung der glomerulären Filtrationsbarriere hinweist. Wichtig ist, dass die MMF-Therapie die Struktur von FPs leicht verbessern könnte. Der Mangel an statistischer Signifikanz könnte durch die kurze MMF-Exposition oder die relativ geringe Anzahl analysierter Glomeruli im heterogenen NTN-Modell erklärt werden. Zusammenfassend bestätigten unsere STED-Daten die Proteomikdaten, indem sie eine Tendenz zur Wiederherstellung der FP'-Struktur zeigten und auf eine Stabilisierung des Aktin-Zytoskeletts in der MMF-Gruppe schließen ließen.

Wir erkennen an, dass unsere Studie auch mit mehreren Einschränkungen verbunden ist: (1) Wir fanden heraus, dass eine einwöchige MMF-Behandlung die Proteinurie verbesserte, jedoch nicht signifikant. Somit hat MMF das Potenzial, Signalwege und histologische Veränderungen bei NTN positiv zu beeinflussen, aber entweder war die Therapiedauer in unserem reversiblen Modell zu kurz oder MMF allein hat nur eine begrenzte Wirksamkeit, um eine vollständige Remission der Proteinurie infolge des Zusammenspiels von a zu induzieren Fülle von Downstream-Signalwegen. (2) Wir waren auch nicht in der Lage, die Mikrodomänen-Ca2+-Signalisierung an der Zellmembran mit unserem zytosolischen Calciumindikator aufzulösen, da die [Ca2+]i-Bildgebung mittels Multiphotonenmikroskopie eher als indirekte Anzeige aller Ca2+-Kanäle dient und das gesamte [Ca2+]i anzeigt . Dieser Anstieg von [Ca2+]i im gesamten Podozyten spiegelt jedoch einen Zusammenbruch der Mechanismen zur Steuerung der Ca2+-Signalübertragung in der Mikrodomäne wider. Unserer Meinung nach könnte dies den Allgemeinzustand der Podozyten noch besser widerspiegeln. (3) Da sich unsere Studie auf Podozyten konzentrierte, können wir nicht ausschließen, dass MMF gleichzeitig die Funktion verletzter Mesangialzellen und glomerulärer Endothelzellen verbesserte. Daher könnten die beobachteten Effekte in Podozyten auch durch verändertes glomeruläres zelluläres Cross-Talk beeinflusst worden sein. (4) Schließlich war es eine Herausforderung, die systemischen Auswirkungen der Immunsuppression durch MMF klar von ihren direkten Auswirkungen auf die glomerulären Zellen zu unterscheiden, da sie in einem In-vivo-Modell untrennbar miteinander verbunden sind, obwohl dies der Situation bei unseren Patienten ähnelt. Dennoch glauben wir, dass die Anwendung gezielter [Ca2+]i-Bildgebung und STED-Studien an Podozyten dazu beigetragen hat, die spezifische direkte Wirkung auf Podozyten zu verstehen.

Zusammenfassend identifizierten wir durch MPA regulierte Signalwege in Glomeruli und enthüllten ein neues mechanistisches Verständnis darüber, wie MMF die Proteinurie auf podozytenspezifische Weise über seine systemische immunsuppressive Wirkung hinaus reduziert: MMF trägt zur Normalisierung von [Ca2+]i bei und verbessert das desorganisierte Aktin-Zytoskelett in Podozyten und verbessert so die Funktion der glomerulären Barriere. Zusammenfassend liefert unsere Studie die pathophysiologische Begründung für die Nutzung der direkten Wirkung von MMF auf Podozyten zusätzlich zu seiner immunsuppressiven Wirkung bei proteinurischen Glomerulopathien, um eine wirksamere Behandlung mit möglichst geringen Nebenwirkungen zu erreichen.

Die Massenspektrometrie-Proteomikdaten wurden über das PRIDE43-Partner-Repository mit der Datensatzkennung PXD039915 beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt.

Akute Niereninsuffizienz

Calciumion

Intrazelluläre Ca2+-Konzentration

Fußprozess

Gen-Ontologie

Inosin-5′-Monophosphat-Dehydrogenase

Krebs-Henseleit-Puffer

Mycophenolatmofetil

Mycophenolsäure

Nephrotoxische Serumnephritis

Nephrotoxisches Serum

Periodsäure–Schiff

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

Paraformaldehyd

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Schlitzmembran

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Wir danken S. Keller, S. Greco-Torres und A. Köserand für die hervorragende technische Unterstützung. Die Autoren würdigen die herausragende Hilfe der CECAD-In-vivo-Forschungseinrichtung (Leiter: Dr. Zevnik), der CECAD-Proteomics-Einrichtung (Leiter: Dr. Lackmann) und der CECAD-Bildgebungseinrichtung (Leiter: Dr. Schauss).

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL. AH ist Inhaber einer „Gerok Stelle“, eines GPN-Stipendiums (Deutsche Gesellschaft für Pädiatrische Nephrologie) und eines Stipendiums der Peter Stiftung. AH und SAZ wurden durch das Cologne Fortune-Stipendium finanziert. JB-L., MJH und EW wurden durch das DFG-Stipendium HA6212/3 im Rahmen des CRU329 unterstützt. PD wurde gefördert von der Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2022_EKEA.90). Wir bedanken uns für die Unterstützung der Artikelbearbeitungsgebühr durch die DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, 491454339).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: A. Hackl und E. Nüsken.

Klinik für Pädiatrie, Medizinische Fakultät, Universitätsklinikum Köln, Universität zu Köln, Kerpener Straße 62, 50937, Köln, Deutschland

A. Hackl, E. Nüsken, J. Voggel, SED Abo Zed, G. Fink, C. Dafinger, M. Wohlfarth, K.-D. Nüsken & LT Weber

CECAD, Medizinische Fakultät, Universitätsklinikum Köln, Universität zu Köln, Köln, Deutschland

A. Hackl, S. E. D. Abo Zed, J. Binz-Lotter, D. Unnersjö-Jess, K. Bohl, E. Wiesner, P. Diefenhardt, C. Dafinger, H. Chen, R.-U. Müller, M. J. Hackl & B. Schermer

Abteilung 2 für Innere Medizin, Medizinische Fakultät, Universitätsklinikum Köln, Universität zu Köln, Köln, Deutschland

J. Binz-Lotter, D. Unnersjö-Jess, K. Bohl, E. Wiesner, P. Diefenhardt, H. Chen, R.-U. Müller, M. J. Hackl & B. Schermer

Abteilung für Therapeutisches Arzneimittelmonitoring, Pharmakologie am Laborzentrum, Medizinische Fakultät, Universitätsklinikum Köln, Universität zu Köln, Köln, Deutschland

C. Müller

Zentrum für Seltene Nierenerkrankungen Köln, Medizinische Fakultät, Universitätsklinikum Köln, Universität zu Köln, Köln, Deutschland

R.-U. Müller & LT Weber

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Die Experimente wurden von AH, EN, JV, JB-L., DU-J., CM, MJH, KDN und LTW entworfen. Experimente wurden von MJH, JV, SEDAZ, JB-L., DU-J., CM, GF durchgeführt. EW, PD, MW, CD und HC Die Datenanalyse wurde von AH, EN, JV, JB-L., DU-J., CM, PD und KB durchgeführt. Das Manuskript wurde von AH, EN, K.-DN und verfasst LTWLTW, K.-DN, BS, AH und RUM stellten Anleitung und Ressourcen zur Verfügung.

Korrespondenz mit A. Hackl.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Hackl, A., Nüsken, E., Voggel, J. et al. Die Wirkung von Mycophenolatmofetil auf Podozyten bei nephrotoxischer Serumnephritis. Sci Rep 13, 14167 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41222-1

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Eingegangen: 28. April 2023

Angenommen: 23. August 2023

Veröffentlicht: 29. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41222-1

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Die Wirkung von Mycophenolatmofetil auf Podozyten bei nephrotoxischer Serumnephritis